Senin, 25 April 2011

Laporan Isolasi DNA


Hari dan Tanggal     :    Selasa, 22 Juni 2010
Judul                        :      Isolasi DNA
Tujuan                     :
Untuk menentukan kemurnian dan konsentrasi DNA terhadap dua parameter, yaitu garam dan protein.
Prinsip                    :
            Sel dipecah untuk mendapatkan DNA, kemudian DNA diikatkan dalam suatu fasa padat, yaitu silica. Setelah itu dilakukan penghilangan pengotor dengan pencucian menggunakan buffer, kemudian dielusi.
Dasar Teori          :
Deoxyribonucleic acid (DNA) isolasi adalah proses ekstraksi DNA dari berbagai sumber. Sumber untuk isolasi DNA sangat beragam. Pada dasarnya dapat diisolasi dari organisme hidup atau mati. Sumber-sumber umum untuk isolasi DNA meliputi seluruh darah, rambut, sperma, tulang, kuku, jaringan, noda darah, air liur, bukal (pipi) kapas, sel epitel, urin.
Metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA tergantung pada sumber, umur, dan ukuran sampel. Meskipun berbagai metode yang digunakan ada beberapa kesamaan di antara mereka. Secara umum, mereka bertujuan untuk menyajikan DNA terpisah dalam inti sel dari komponen seluler lainnya.
Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik, yang digunakan untuk tujuan ilmiah, medis, atau forensik. Para ilmuwan menggunakan DNA di sejumlah aplikasi, seperti pengenalan DNA ke dalam sel dan binatang atau tanaman, atau untuk tujuan diagnostik. Dalam obat aplikasi yang terakhir adalah yang paling umum. Di sisi lain, ilmu forensik perlu memulihkan DNA untuk identifikasi individu (bagi pemerkosa misalnya, pencuri kecil, kecelakaan, atau korban perang), penentuan ayah, dan pabrik atau identifikasi hewan.
Keberadaan protein, lipid, polisakarida dan beberapa senyawa organik atau anorganik lainnya dalam penyusunan DNA dapat mengganggu metode analisis DNA, khususnya dengan reaksi rantai polimerase (PCR). Mereka juga dapat menurunkan mutu DNA yang mengarah ke penyimpanan yang lebih pendek. Setelah itu, melalui aplikasi dari deterjen, protein dan lipid selular terpisah jauh dari DNA.
Isolasi DNA biasanya dimulai dengan lisis atau rusaknya jaringan atau sel. Proses ini sangat penting untuk penghancuran struktur protein dan memungkinkan untuk pelepasan asam nukleat dari inti. Lisis dilakukan dalam larutan garam, deterjen yang mengandung protein denaturasi atau protease (enzim mencerna protein), seperti proteinase K. Hal ini mengakibatkan kerusakan sel dan melarutkan membran. Isolasi DNA adalah sebuah proses yang sederhana.
Sejumlah kit pemurnian DNA menggunakan prinsip-prinsip komersial yang sama tapi reagen berbeda. Dalam kit komersial solusi lisis umum mengandung: natrium klorida, trometamin (juga dikenal sebagai Tris), yang merupakan buffer untuk mempertahankan pH konstan, asam ethylenediaminetetraacetic (EDTA) yang mengikat ion logam, dan natrium sulfat dodesil (SDS) yang adalah deterjen. Sebuah enzim yang umum digunakan dalam ekstraksi DNA adalah proteinase K.
Metode tertua pemurnian DNA di laboratorium, masih sering digunakan juga, mengandalkan campuran pelarut organik. Sampel yang sudah lisis dicampur dengan fenol, kloroform, dan isoamylalcohol untuk pemisahan DNA dan protein. Protein didenaturasi dengan campuran organik. Ketika sampel disentrifugasi, DNA dipertahankan dalam air lapisan, fenol di bagian bawah tabung, dan protein didenaturasi membentuk antarmuka berawan. Metode ini sangat efisien, tetapi sayangnya hanya dapat digunakan jika jumlah bahan awal cukup melimpah. Selain itu, pelarut organik yang digunakan membawa masalah kesehatan dan keselamatan. Kualitas DNA dari prosedur ini biasanya tidak cukup untuk beberapa teknik analitis lebih sensitif (terutama sequencing dan kadang-kadang PCR).
Sebuah modifikasi metode menggunakan garam tinggi (natrium klorida, NaCl) konsentrasi untuk menurunkan DNA. Setelah denaturasi protein selular yang menggunakan deterjen dan protease untuk beberapa jam atau semalam, garam ditambahkan dan dicampur dengan solusinya. Akibatnya, garam asam nukleat terbentuk dan di hadapan alkohol dapat dipulihkan dengan sentrifugasi.
Kadang-kadang, denaturasi alkali sampel digunakan untuk melepaskan DNA dari sel. Usapan bukal dan kadang-kadang noda darah dapat ditempatkan dalam tabung plastik kecil (eppendorfs) dan mengalami denaturasi dengan sodium hidroksida (NaOH). Solusi tersebut kemudian kembali ke pH netral ekuilibrasi dengan larutan buffer lebih asam dan siap untuk PCR. Meskipun metode yang cepat dan sederhana, kualitas DNA tidak selalu cukup untuk semua aplikasi.
Sebuah metode yang mirip dengan basa denaturasi adalah denaturasi panas, dicapai dengan merebus sampel. Pemanasan sampel untuk 100 ° C DNA rilis ke solusi, tetapi juga denaturasi dengan memisahkan kedua untai. Dalam beberapa kasus prosedur ini memberikan asam nukleat yang memadai yang dapat diamplifikasi dengan PCR. Namun, sebagian besar masih ada sisa inhibitor dalam bentuk protein terdegradasi, senyawa organik lainnya, atau ion.
Sebuah metode terkait digunakan di laboratorium forensik umumnya menggunakan resin pertukaran ion Chelex yang mengikat ion logam multivalent dan ini bermanfaat dalam menghilangkan inhibitor dari DNA. Hal ini dapat digunakan dengan semua jenis sampel, termasuk darah utuh, noda darah, noda mani, kapas bukal, atau bulu. Satu-satunya perbedaan dari metode sebelumnya adalah adanya resin, yang mengikat kotoran dari solusi, sedangkan DNA yang tertinggal dalam solusi. Dengan pemusingan sampel, resin dibawa ke pellet dan terpisah.
Metode lain yang mirip dengan Chelex bergantung pada penggunaan manik-manik paramagnetik dengan kapasitas pengikatan DNA. Sampel yang lisis dan kemudian bahan padat diperlakukan dengan proteinase K. Lisat kemudian diaplikasikan ke manik-manik. Resin selanjutnya dicuci dan DNA eluen itu pada 65°C, manik-manik magnetik dipisahkan dari sampel di atas meja magnetik.
Metode lainnya untuk pemurnian DNA melibatkan berbagai macam kolom, yang dikemas dengan pertukaran ion, atau resin berbasis silika atau matriks. Kolom pertukaran Ion umumnya bermuatan positif untuk mengikat DNA bermuatan negatif; matriks silika juga diisi dan juga dapat mempertahankan DNA. Dalam aplikasi seperti DNA dari lisat seluler diharapkan untuk mengikat ke kolom. Kolom ini kemudian dicuci menggunakan solusi garam untuk menghapus materi terikat. Asam nukleat kemudian pulih dengan menggunakan air atau larutan garam pH netral untuk memecah ikatan resin-DNA.
Penggunaan kolom memungkinkan peningkatan throughput sampel, waktu yang lebih singkat dibandingkan dengan isolasi ekstraksi pelarut berbasis tradisional, peningkatan hasil panen DNA pulih, dan peningkatan kualitas DNA dimurnikan.
Selain kolom dan resin telah dijelaskan sebelumnya, ada juga resin cair yang digunakan. Prinsipnya adalah sama seperti untuk manik-manik magnetik, tapi pada langkah terakhir sampel harus berputar ke DNA terpisah dari resin.
Semua metode ini berhasil digunakan di berbagai laboratorium dan dengan berbagai contoh. Metode harus benar dipilih untuk mengoptimalkan hasil dan kualitas DNA diekstraksi.
Description: D:\kuliah q\biomol\iso5_files\iws_n.pngDescription: D:\kuliah q\biomol\iso5_files\iws_n.pngDescription: D:\kuliah q\biomol\iso5_files\iws_w.pngDescription: D:\kuliah q\biomol\iso5_files\iws_e.pngDescription: D:\kuliah q\biomol\iso5_files\iws_s.pngDescription: D:\kuliah q\biomol\iso5_files\iws_s.pngDescription: D:\kuliah q\biomol\iso5_files\iws_c.png
Description: D:\kuliah q\biomol\iso5_files\iw_n.pngDescription: D:\kuliah q\biomol\iso5_files\iw_n.pngDescription: D:\kuliah q\biomol\iso5_files\iw_w.pngDescription: D:\kuliah q\biomol\iso5_files\iw_e.pngDescription: D:\kuliah q\biomol\iso5_files\iw_s0.pngDescription: D:\kuliah q\biomol\iso5_files\iw_s0.pngDescription: D:\kuliah q\biomol\iso5_files\iw_c.png
Alat & Bahan                   :          
Bahan          :                                               Alat   :
1.     Darah                                                            1. Gene quant
2.     Binding Buffer                                2. Mixer “Maxi mix plus”
3.     Proteinase K                                  3. Centrifuge
4.     Isopropanol                                                4. Microtube
5.     Inhibitor Removal Buffer                        5. Collection tube
6.     Wash Buffer                                                6. Mikropipet
7.     Elution Buffer
8.     Double Destilat H2O
Prosedur               :
1.     Dipipet 200µL sampel darah, dimasukkan kedalam microtube.
2.     Ditambah 200µL Binding Buffer dan 40µL Proteinase K, dihomogenkan menggunakan mixer.
3.     Diinkubasi pada suhu 70ºC selama 10 menit.
4.     Ditambah 100µL isopropanol, dihomogenkan menggunakan mixer.
5.     Dipipet seluruh sampel, dipindahkan ke dalam collection tube, kemudian dicentrifugasi 8000g selama 1 menit.
6.     Dibuang flowthrough dan collection tube, silica dimasukkan ke dalam collection tube baru.
7.     Ditambahkan 500µL inhibitor removal buffer, dicentrifugasi 8000g selama 1 menit.
8.     Dibuang flowthrough dan collection tube, silica dimasukkan ke dalam collection tube baru.
9.     Ditambahkan 500µL wash buffer, dicentrifugasi 8000g selama 1 menit.
10.      Dibuang flowthrough dan collection tube, silica dimasukkan ke dalam collection tube baru.
11.      Ditambahkan 500µL wash buffer, dicentrifugasi pada kecepatan penuh selama 10 detik.
12.      Dibuang flowthrough dan collection tube, silica dimasukkan ke dalam mikrotube.
13.      Ditambahkan 200µL Elution buffer yang sudah dipanaskan, dicentrifugasi 8000g selama 1 menit dan didapat isolat DNA.
14.      Untuk pengujian konsentrasi dan kemurnian, DNA harus diencerkan 1/10 kali dengan dipipet 7µL isolat DNA, ditambah 63µL DD H2O.
15.      Kemudian dibaca absorbance pada alat Gene Quant terhadap garam dan protein yang dibaca pada panjang gelombang 260nm untuk DNA, 230nm untuk garam dan 280nm untuk protein.
16.      Dicatat hasil.



Hasil                         :
§      Concentration       : 22,85 µg/mL
§      230                             : 0,524A
§      280                             : 0,399A
§      260                             : 0,457A
§      260/230                    : 0,872
§      260/280                    : 1,145
Pembahasan        :
            Berdasarkan praktikum didapat hasil kemurnian isolasi DNA terhadap protein adalah 1,145. Sedangkan berdasarkan teori hasil kemurnian isolasi DNA harus berada pada rentang 1,6 sampai 2,00. Hal ini mungkin disebabkan karena masih terdapat pengotor-pengotor, debris-debris yang tidak dibutuhkan, kontaminasi protein, dan sampel yang digunakan bukan sampel baru yang masih segar melainkan sampel yang sudah lama. Sehingga menghasilkan pemurnian DNA dibawah 1,6. Oleh karena itu, sebaiknya sampel harus dimurnikan ulang. Tetapi untuk tolerir karena sampel yang digunakan sudah lama maka masih dapat digunakan untuk pemeriksaan selanjutnya.
Kesimpulan          :
Berdasarkan praktikum, dari hasil isolasi DNA didapat concentration 22,85 µg/mL, kemurnian terhadap protein 1,145, dan kemurnian terhadap garam 0,872. Dari hasil tersebut, isolat DNA masih dapat digunakan untuk pemeriksaan selanjutnya.
Daftar Pustaka  :

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar