PCR DAN ELEKTROFORESIS
Disusun Untuk Memenuhi Salah Satu Tugas Mata Kuliah Biologi Molekuler II
Di susun oleh :
| Alisia Salini Dabut | 411109035 |
| Oki Silviana Kusumadewi | 411109036 |
| Riska Dian Ramadhani | 411109037 |
| Diana Budiarti | 411109038 |
| Alliza Rizky Ayu | 411109039 |
| Yayah Herliana | 411109040 |
| Yondy Fitriana | 411109041 |
| Nunik Puspitasari | 411109042 |
| Anggie Anarahmy | 411109043 |
| Laduna | 411109044 |
| Yusni Yuspita | 411109045 |
| Susilawati | 411109046 |
PRODI ANALIS KESEHATAN (D-III)
SEKOLAH TINGGI ILMU KESEHATAN JENDERAL AHMAD YANI CIMAHI
TA. 2010/2011
Hari dan Tanggal : Senin, 13 Desember 2010
Judul : PCR dan Elektroforesis
Tujuan :
Untuk mendeteksi Mycobacterium tuberculosis secara cepat dengan metode PCR dan Elektroforesis dengan gel agarosa.
Prinsip :
DNA bakteri diamplifikasi dengan metode PCR agar diperoleh DNA dalam jumlah besar melalui siklus yang berulang-ulang. Tiap siklus terdiri atas tiga tahap reaksi yaitu denaturasi untuk memperoleh DNA rantai tunggal, annealing untuk menempelkan primer pada DNA rantai tunggal, dan extension untuk memperpanjang primer menjadi DNA rantai tunggal yang komplementer. Selanjutnya DNA dielektroforesa dan divisualisasi dengan ethidium bromide menggunakan alat translumineter.
Dasar Teori :
PCR adalah suatu metode untuk mengamplifikasi sekwens gen target secara eksponensial in vitro. Pada reaksi ini dibutuhkan: DNA target, sepasang primer, polimerase DNA yang termostabil, buffer reaksi dan alat thermal cycler.
Ukuran target untuk amplifikasi biasanya kurang dari 700-1000 pasang basa (bp), tetapi target dari spesimen klinik yang efisien untuk diamplifikasi antara 100-400 bp. Walaupun target panjang dapat juga diamplifikasi namun prosesnya kurang efisien, karena produknya yang panjang lebih rentan terhadap inhibitor yang mempengaruhi kerja enzim polimerase, di samping itu waktu untuk amplifikasi jadi lebih panjang (Persing, 1993b).
Dalam memilih target yang akan diamplifikasi, yang paling penting diperhatikan adalah stabilitas genetik dari target. Perubahan atau hilangnya sekwens target akan berakibat hilangnya reaktivitas. Bagian dari plasmid atau transposon yang membawa sifat virulensi suatu bakteri adalah salah satu contoh elemen genetik yang potensial tidak stabil. Padahal deteksi sekwens target yang berhubungan dengan virulensi tersebut penting untuk membedakan antara organisme patogen dan non patogen. Elemen genetik ini bisa hilang waktu isolasi primer atau pemindahan serial. Dalam hal ini, amplifikasi sebaiknya dilakukan segera setelah isolasi atau langsung dari sampelnya (Persing, 1993b).
Faktor yang paling penting dalam reaksi PCR adalah karakteristik primer dan bagaimana mereka secara spesifik berikatan dengan target. Ada beberapa hal penting yang perlu diperhatikan dalam merancang primer:
1. Spesifisitas.
2. Hindari primer yang dapat mengadakan hibiridisasi silang satu sama lain atau saling melipat sendiri.
3. Satu sel primer hendaknya mempunyai Tm (melting temperature) yang mirip.
4. Sekwens dengan kandungan GC 50-60 %.
Jadi, yang perlu diperhatikan dalam merancang primer adalah: panjang oligonukleotida, Tm, komposisi sekwens, karakteristik sekwens (self-annealing), interaksi primer, panjang target dan lokasi pada sekwens target.
Enzim polimerase termostabil yang diisolasi dari Thermus aquaticus (Taq polymerase) merupakan polimerase termostabil yang pertama kali ditemukan dan saat ini banyak digunakan. Taq mempunyai aktifitas polimerisasi DNA 5’-3’. Aktivitas enzimatik dari Taq polymerase mempunyai waktu paruh sekitar 40 menit pada 95°C.
Buffer Taq standard terdiri dari :
1. 10mM Tris-HCl pH 8.4
2. 50mM KCl
3. 1.4 mM MgCl2
4. 0.01% gelatin
Komposisi buffer diatas pada umumnya optimum untuk sebagian besar reaksi PCR.
Alat thermal cycler (mesin PCR) yang secara tepat meregulasi temperatur dan siklus waktu dibutuhkan untuk menjamin reprodusebilitas dan keakuratan dari reaksi amplifikasi. Perbedaan antara temperatur yang telah di-set dan temperatur yang sebenarnya didalam semua sumuran mesin PCR tidak boleh lebih dari 1°C. Seperti diketahui, siklus terdiri dari denaturasi (94°C, selama 30-60 detik), annealing/hibridisasi (45-60°C, 60-120 detik) dan perpanjangan rantai (72°C, 60-120 detik). Siklus kemudian diulang 20-35 kali. Biasanya dibutuhkan denaturasi awal pada 94°C selama 4-5 menit sebelum siklus dimulai.
Teknik hot-start dilakukan untuk menghindari pembentukan produk non spesifik, dengan cara tidak mencampurkan dahulu salah satu komponen esensial dari reaksi misalnya enzim polimerase. Hal ini untuk mencegah supaya tidak terjadi polemerisasi pada temperatur rendah (nonsringent). Setelah temperaturnya meningkat, barulah enzim tersebut ditambahkan.
Macam PCR :
1. Multiplex PCR
2. Deteksi point mutation
3. Determinasi sekwen
4. Nested ampflification
5. Deteksi target RNA
6. PCR kwantitatif
Salah satu keunggulan dari amplifikasi asam nukleat seperti PCR adalah sensitivitasnya yang sangat tinggi. Pentingnya penggunaan kontrol dalam PCR , untuk membuktikan :
1. PCR yang kita kerjakan tersebut telah dikerjakan atau berjalan dengan benar.
2. Yang diamplifikasi adalah target yang memang diinginkan dan bukan kontaminan atau carry-over.
Kontrol terhadap amplicon carry-over (carry-over control ) dapat dilakukan dengan 2 cara:
1. Enzimatik
2. Kimiawi
Kedua cara kontrol diatas dimaksudkan untuk menekan kontaminasi oleh amplified DNA.
PCR telah digunakan secara luas dalam bidang kedokteran, seperti: berbagai penyakit menular (deteksi berbagai bakteri, virus, jamur dan parasit), keganasan (misalnya carcinoma, limfoma, leukimia, retinoblastoma), kelainan genetika (Sickel cell anemia, β-thalassemia, Duchenne’s muscullar dystrophy, cystic fibrosis, hemophilia A, Tay-Sachs disease dan phenylketonuria) dan kedokteran kehakiman (Innis, 1990; Bej-et al, 1991; White, 1992; Persing, 1993a).
PCR dapat mempercepat waktu diagnosis Mycobacterium tuberculosis dari empat minggu menjadi hanya 1-2 hari, sehingga terapi yang tepat bisa segera di mulai.
Elekroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul seluler berdasarkan atas ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarosa, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke ketub yang berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk molekulnya.
Teknik elektroforesis dapat digunakan untuk analisis DNA, RNA, maupun protein. Elektroforesis DNA dilakukan misalnya untuk manganalisis fragmen - fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi. Fragmen molekul DNA yang telah dipotong-potong dapat ditentukan ukurannya dengan cara membuat gel agarosa, yaitu suatu bahan semi-padat berupa polisakarida yang di ekstraksi dari rumput laut. Gel agarosa dibuat dengan melarutkannya dalam suatu buffer. Agar dapat larut dengan baik, pelarutannya dibantu dengan pemanasan, misalnya menggunakan oven gelombang mikro (microwave oven). Dalam keadaan panas, gel akan berupa cairan sehingga mudah dituang ke atas suatu lempeng (plate) yang biasanya terbuat dari Perspex. Sebelum mendingin dan memadat, pada ujung gel tersebut dibuat lubang - lubang dengan menggunakan lembaran Perspex tipis yang dibentuk menyerupai sisir. Sisir tersebut ditancapkan pada salah satu ujung gel yang masih cair. Dengan demikian, pada waktu gel memadat dan sisirnya diambil terbentuklah lubang - lubang kecil. Ke dalam lubang - lubang kecil itulah sampel molekul DNA dimasukkan. Gel agarosa yang sudah terbentuk kemudian dimasukkan ke dalam suatu tanki yang berisi buffer yang sama dengan yang digunakan untuk membuat gel. Buffer dapat dibuat misalnya dengan Tris-asetat-EDTA (TAE) atau Tris-borat-EDTA (TBE).
Setelah DNA dimasukkan kedalam lubang sampel, arus listrik dialirkan. Kutub yang sejajar dengan lubang sampel DNA berupa kutub negatif, sedangkan kutub lainnya positif. Oleh karena DNA bermuatan negatif maka molekul - molekul DNA akan bergerak kearah kutub positif. Setelah beberapa waktu gel kemudian direndam dalam larutan yang mengandung etidium bromida. Etidium bromida akan menginterkalasi (menyisip ke dalam) DNA. Penggunaan etidium bromida dimasudkan untuk membantu visualisasi karena etidium kromida akan memendarkan sinar ultraviolet. Jika gel disinari dengan ultraviolet dari bawah, maka akan tampak citra berupa pita - pita pada gel. Pita - pita tersebut adalah molekul - molekul DNA yang bergerak sepanjang gel setelah di elektroforesis. Molekul RNA dapat dianalisis dengan prinsip yang sama, yaitu menggunakan gel agarosa, namun dengan menggunakan buffer yang berbeda yaitu yang mengandung formaldehid.
Mikobakteria adalah bakteri aerob, berbentuk batang, yang tidak membentuk spora. Walaupun tidak mudah diwarnai, jika telah diwarnai bakteri ini tahan penghilangan warna (dekolorisasi) oleh asam atau alcohol dan karena itu dinamakan basil “tahan asam”. Mycobacterium tuberculosis menyebabkan tuberculosis dan merupakan pathogen yang sangat penting bagi manusia. Aktivitas biokimianya tidak khas, dan laju pertumbuhannya lebih lambat daripada kebanyakan bakteri lain. Waktu penggandaan basil tuberkel adalah sekitar 18 jam. Penting untuk mengkarakterisasikan dan memisahkan M.tuberculosis dari semua spesies mikobakteria lainnya. Metode konvensional untuk mengklasifikasikan mikobakteria secara cepat telah menjadi sejarah masa lalu saja, karena metode pananda molekuler jauh lebih cepat dan lebih mudah.
Penanda molekuler menyediakan metode yang cepat, sensitive, dan spesifik untuk mengidentifikasi mikobakteria. Penanda dapat digunakan pada mikobakteria yang tumbuh dari perbenihan padat atau dari biakan kaldu. Penanda DNA spesifik untuk urutan rRNA dari tes organisme digunakan pada prosedur hibridisasi. Terdapat kurang lebih 10.000 salinan rRNA per sel mikobakteria, memungkinkan system penguat alami, meningkatkan pendeteksian. Hibrida untai ganda dipisahkan dari penanda untai tunggal yang tidak terhibridisasi. Penanda DNA terkait pada struktur kimia yang teraktivasi pada hibrida dan terdeteksi oleh kemiluminesens. Dengan digunakannya penanda ini, maka telah memperpendek waktu untuk mengidentifikasi mikobakterium yang penting secara klinik dari beberapa minggu sampai paling sedikit satu hari.
Reaksi rantai polymerase menjanjikan suatu cara pendeteksian M.tuberculosis secara cepat dan langsung pada bahan klinik. Secara keseluruhan, sensitivitasnya 80-85% dengan spesifisitasnya 99%.
Alat & Bahan :
Bahan : Alat :
1. Master Mix (Gotaq Polymerase) 1. Thermal Cycler C1000
2. DNA Template 2. Vortex Mixer “Maxi mix plus”
3. Primer Forward 3. Laminar Air Flow
4. Primer Reverse 4. Microtube
5. Control positif 5. Centrifuge
6. Control negatif 6. Mikropipet
7. ddH2O 7. Alat Elektroforesis
8. Sampel 8. Translumineter
Prosedur :
1. Dipipet Gotaq Polymerase sebanyak 13μL kedalam tabung control positif, control negative, dan tabung sampel.
2. Ditambah 1µL Primer Forward pada ketiga tabung.
3. Ditambah 1µL Primer Reverse pada ketiga tabung.
4. Ditambah 10µL DNA Template M.tbc pada tabung sampel.
5. Ditambah 1µL DNA Template dan 9µL ddH2O pada tabung control positif.
6. Ditambah 10µL ddH2O pada tabung control negative.
7. Dicentrifuge 8000 rpm selama 30 detik.
8. Dirunning di alat Thermal Cycler dengan program 30 cycle pada suhu 105o.
9. Setelah 3 jam dilakukan elektroforesis, dipipet control positif, control negative, dan sampel masing-masing 10µL ke dalam well agarose yang telah direndam dalam alat elektroforesa.
10. Dialiri listrik 100 volt selama 60 menit, kemudian direndam dalam ethidium bromide selama 15 menit.
11. Dibaca dengan alat translumineter (sinar UV).
Hasil :
Pembahasan :
Berdasarkan praktikum, didapat hasil pada gel agarosa, sampel yang di uji menandakan positif TBC, karena terbentuk band atau pita yang sejajar antara control positif dan sampel, sedangkan pada control negative tidak terbentuk band atau pita. Karena apabila pada control negative terbentuk band atau pita maka pemeriksaan harus diulang, karena kemungkinan ada kontaminasi dan salah pada saat tahap isolasi. Setiap running pemeriksaan harus selalu ada marker, karena marker digunakan sebagai penanda dan untuk mengetahui berapa ukuran base pair pada sampel yang positif.
Kesimpulan :
Hasil PCR dan elektroforesis untuk identifikasi Mycobacterium tuberculosis adalah positif TBC.
Daftar Pustaka :
7. Jawetz, Melnick & Adelberg. 1996. Mikrobiologi Kedolteran Edisi 20. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.
8. Suhartono Taat Putra. 1999. Biologi Molekuler Kedokteran Edisi Pertama. Surabaya: Airlangga University Press.
9. Yuwono, Triwibowo. 2008. Biologi Molekular. Jakarta: Penerbit Erlangga.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar